Polimorfisme Panjang Cebisan Pemotongan atau Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) merupakan salah satu teknik yang digunakan dalam kaedah pemprofilan DNA iaitu kaedah menentukan ciri DNA subjek yang dikaji.

Berdasarkan nama teknik RFLP ini, kaedah yang digunakan adalah dengan menggunakan sejenis enzim untuk memotong satu jujukan DNA yang panjang di mana polimorfisme berlaku.

Polimorfisme adalah keadaan dalam DNA di mana terdapatnya kewujudan lebih daripada satu bentuk gen pada kromosom yang berasingan.

RFLP boleh dilakukan pada kedua-dua kawasan DNA iaitu kawasan kod pengekodan (kawasan maklumat diwariskan) dan bukan pengkodan (kawasan yang tidak mengandungi maklumat DNA).

Secara konsepnya, disebabkan terdapat variasi dalam jujukan DNA homolog (DNA sejenis), perbezaan antara dua atau lebih contoh DNA homolog yang timbul apabila dipotong dengan enzim, kita dapat membezakan dan membandingkan perbezaan tersebut menggunakan teknik makmal yang berkaitan.

Satu jujukan DNA tertentu yang dikehendaki boleh ‘diikuti’ dan dikesan kerana DNA akan diwarisi ke sel-sel lain. Oleh itu, teknik RFLP telah menjadi alat yang berguna untuk analisis yang melibatkan sampel DNA seperti dalam ujian paterniti, pemetaan genom dan gen, penentuan risiko untuk penyakit dan membantu siasatan jenayah.

Kelebihan

• Kebolehulangan yang tinggi.
• Corak pembandingan yang muktamad.
• Jujukan DNA boleh dibanyakkan pada tapak pemotongan.
• Menunjukkan alel DNA yang ko-dominan

Kelemahan

• Tidak berkesan untuk sampel yang terlalu lama atau tercemar.
• Perlu jumlah sampel yang besar.
• Mengambil masa yang agak lama untuk menyelesaikan prosedur keseluruhan.
• Nilai kos kit yang agak mahal.

Prinsip dan Prosedur

1. Pengekstrakan DNA

Sampel diperoleh menggunakan swabbing atau pengumpulan dari tempat kejadian. DNA diekstrak dari sampel menggunakan prosedur yang ditetapkan.

2. Fragmentasi DNA

DNA yang diekstrak perlu dipecahkan. Enzim sekatan digunakan untuk memotong DNA pada jujukan tertentu.

3. Penyusunan Fragmen DNA

Jujukan DNA disusun sesuai dengan saiz mereka menggunakan elektroforesis gel agarose. Gel agarose adalah bahan seperti jeli yang mengandungi liang untuk laluan DNA. Arus elektrik digunakan, yang membolehkan molekul DNA bergerak melalui gel, mengakibatkan pemisahan dalam bentuk fragmen. Saiz yang lebih kecil akan bergerak dengan lebih cepat.

4. Nyahasli (denaturation)

Ikatan heliks ganda dua DNA boleh dikaitkan dengan ikatan hidrogen yang kuat. Larutan alkali digunakan untuk memecahkan ikatan hidrogen dengan prinsip tindak balas asid. Jaluran tunggal DNA dihasilkan.

5. Southern Blotting / Pemindahan

Gel agarose tidak lagi sesuai untuk digunakan dalam prosedur RFLP yang seterusnya. Fragmen DNA dipindahkan ke permukaan membran nylon nipis dalam teknik Southern Blotting ini. Fragmen DNA itu kemudiannya akan dianalisis.

6. Hibridisasi Asid Nukleus

Jaluran DNA tunggal akan dipasangkan dengan jaluran pelengkap khusus yang telah dilabelkan dengan isotop radioaktif. Isotop yang biasa digunakan ialah isotop fosforus. DNA yang terhasil melalui proses hibridisasi ini dipanggil sebagai probe DNA.

7. Visualisasi X-ray

Radioaktiviti probe DNA boleh dilihat pada filem X-ray. Hasilnya digunakan untuk membandingkan kedua-dua sampel selepas menjalani semua prosedur yang sama seperti yang dinyatakan di atas.

Aplikasi RFLP

1. Ujian Paterniti

Berikut merupakan contoh hasil RFLP yang digunakan untuk menentukan sama ada Abu merupakan ayah kepada anak Aminah yang bernama Ali.

 

 

Hasil analisis menunjukkan bahawa Abu berkemungkinan tinggi merupakan ayah kepada Ali kerana Ali mewarisi fragmen DNA yang sama seperti Abu.

Namun, masih terdapat kemungkinan lelaki lain dengan corak fragmen yang sama merupakan ayah kandung Ali. Oleh itu, untuk ujian paterniti, lebih banyak loci (garisan fragmen) perlu diuji bagi mengesahkan analisis DNA ini (analisis ini mengesan 2 loci sahaja).

Seterusnya, analisis RFLP diteruskan dengan penambahan sampel DNA. Hasilnya adalah seperti berikut:

 

 

Hasil analisis terbaru ini telah mengesahkan dengan jelas bahawa Abu bukanlah ayah kandung Ali disebabkan fragmen yang diwarisi Ali tidak terdapat pada Abu.

2. Penentuan Risiko Penyakit

Analisis RFLP boleh digunakan untuk menentukan risiko penyakit fibrosis kistik (CF) melalui penentuan alel kromosom dalam keluarga.

CF ialah penyakit resesif yang bermaksud individu dengan alel homozigot (sama) akan mendapat penyakit ini. Individu dengan alel heterozigot (berbeza) akan menjadi pembawa manakala alel jenis liar (wild type) tidak akan menghidapi penyakit ini. Contoh analisis RFLP untuk penentuan alel ini adalah seperti berikut:

Hal ini boleh diaplikasikan dengan meramal risiko anak untuk menghidapi sesuatu penyakit berdasarkan analisis alel ibu bapa.

Jika kedua-dua ibu bapa memiliki alel homozigot jenis WT, semua anak akan mewarisi alel WT untuk penyakit CF menjadikan keluarga tersebut bebas daripada ancaman penyakit tersebut.

Sekiranya ada ibu bapa yang memiliki alel heterozigot pembawa, masih ada risiko untuk anak-anak dilahirkan dengan penyakit tersebut.

3. Profil DNA untuk siasatan kes jenayah

Sebagai contoh, dalam kes rogol, sampel DNA yang diambil adalah seperti

• Air mani dari kemaluan waniita
• Bekas air mani pada pakaian
• DNA mangsa
• Penanda DNA sebagai rujukan
• DNA suspek

Contoh analisis RFLP dan perbandingan yang dibuat adalah seperti berikut:

 

Berdasarkan hasil analisis, Suspek 2 adalah penjenayah yang dicari memandangkan jaluran fragmen DNA yang terbentuk sama dengan bahan bukti.

Rujukan

• Physical Evidence in Forensic Science. Second Edition. Henry C. Lee, Howard A. Harris. Lawyers & Judges Publishing Company. 2000.
• Saiki, RK, Scharf, S, Faloona, F, Mullis, K.B., Erlich, H.A. and Arnheim N (December, 1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230(4732): 1350–4
• http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/RFLP.html
• https://www.newscientist.com/term/dna/
• http://www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/plsc431/markers/marker1.htm http://www.uvm.edu/~cgep/Education/RFLP.html